Được biên tập bởi Peter Sarnow, Trường Y thuộc Đại học Stanford, Đại học Stanford, California, được phê duyệt vào ngày 25 tháng 12 năm 2020 (được đánh giá vào ngày 25 tháng 10 năm 2020)
Chúng tôi báo cáo sự tương tác giữa các tiểu đơn vị trong quá trình sao chép các phức hợp phiên mã coronavirus, rất cần thiết cho sự sao chép và bảo tồn tiến hóa.Chúng tôi đã cung cấp bằng chứng cho thấy miền NiRAN liên kết với nsp12 có hoạt động chuyển gen nucleoside monophosphate (NMP) ở dạng trans và xác định nsp9 (một protein liên kết RNA) là mục tiêu của nó.NiRAN xúc tác liên kết cộng hóa trị của phân tử NMP với đầu amino nsp9 được bảo toàn trong một phản ứng dựa vào các ion Mn2+ và các gốc Asn được bảo toàn liền kề.Người ta nhận thấy rằng hoạt động NiRAN và nsp9 NMPylation rất cần thiết cho sự nhân lên của virus Corona.Dữ liệu cho phép chúng tôi liên kết hoạt động này của chất đánh dấu enzyme virus lồng nhau với các quan sát trước đó với giả thuyết rằng việc bắt đầu tổng hợp RNA trong một lớp virus RNA là nhất quán về mặt chức năng và tiến hóa.
RNA polymerase phụ thuộc RNA (RdRps) của Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae và 12 họ khác) được liên kết với miền đầu cuối amino (N-terminal) trong protein phi cấu trúc (nsp) được giải phóng từ polyprotein, được gọi là NiRAN 1ab bao gồm protease chính của virus (Mpro).Trước đây, hoạt động GMPylation/UMPylation của virus động mạch NiRAN-RdRp nsp đã được báo cáo và người ta đề xuất tạo ra một quá trình tạm thời để chuyển nucleoside monophosphate (NMP) sang virus (hiện chưa rõ) và/hoặc quá trình polyme hóa sinh học tế bào.Ở đây, chúng tôi chỉ ra rằng vi-rút Corona (Human Corona [HCoV]-229E và Virus Corona gây Hội chứng hô hấp cấp tính nặng 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) có hoạt động NMPylation phụ thuộc Mn2+, có nguồn gốc từ nsp9 thông qua sự hình thành nsp9 qua trung gian Mpro. nsps bên cạnh đầu N được giải phóng protein, photphoramidate được liên kết với amin chính (N3825) tại đầu N của nsp9.Uridine triphosphate là nucleotide được ưu tiên trong phản ứng này, nhưng adenosine triphosphate, guanosine triphosphate và cytidine triphosphate cũng là những cơ chất phù hợp.Các nghiên cứu về đột biến sử dụng protein nsp9 và nsp12 của coronavirus tái tổ hợp và các đột biến HCoV-229E được biến đổi gen đã xác định dư lượng cần thiết cho quá trình sao chép nsp9 NMPylation qua trung gian NiRAN và sao chép virus trong nuôi cấy tế bào.Dữ liệu đã xác nhận dự đoán về dư lượng vị trí hoạt động NiRAN và xác định vai trò quan trọng của dư lượng nsp9 N3826 trong nsp9 NMPylation và sao chép virus trong ống nghiệm.Dư lượng này là một phần của chuỗi tripeptide NNE đầu cuối N được bảo tồn và được chứng minh là dư lượng bất biến duy nhất của nsp9 và các chất tương đồng của nó trong họ coronavirus.Nghiên cứu này cung cấp nền tảng vững chắc cho nghiên cứu chức năng về hoạt động NMPylation của các loại virus lồng nhau khác và đề xuất các mục tiêu khả thi để phát triển thuốc chống vi-rút.
Virus RNA sợi dương Nidovirales lây nhiễm nhiều loại động vật có xương sống và động vật không xương sống (1, 2).Bộ hiện nay bao gồm 14 họ (3), trong đó họ Corona đã được nghiên cứu rộng rãi trong 20 năm qua.Vào thời điểm đó, ba loại virus Corona lây truyền từ động vật đã xuất hiện từ vật chủ là động vật và gây ra những đợt bùng phát dịch bệnh nhiễm trùng đường hô hấp nghiêm trọng ở người trên quy mô lớn.Bao gồm cả những đại dịch dai dẳng do bệnh truyền nhiễm cấp tính nặng gây ra.Hội chứng hô hấp do vi rút Corona 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7).Nidovirus có chung một tổ chức bộ gen và tiểu đơn vị của phức hợp sao chép-sao chép gắn màng (RTC) được mã hóa trong hai phần ba đầu 5-?² và tiểu đơn vị cấu trúc chính của hạt virus, cũng như một số phụ kiện. .Protein, được mã hóa ở phần cuối thứ 3??² của bộ gen (1).Ngoại trừ một họ virus hành tinh (Monoviridae) (8), tất cả các virus lồng nhau đều mã hóa các tiểu đơn vị RTC trong hai khung đọc mở lớn (ORF) ORF1a và ORF1b, được dịch từ RNA bộ gen của.ORF1a mã hóa polyprotein (pp) 1a và ORF1a và ORF1b cùng mã hóa pp1ab.Với sự tham gia chung của protease chính (Mpro) được mã hóa bởi ORF1a, cả pp1a và pp1ab đều được xử lý phân giải protein thành nhiều loại protein phi cấu trúc (nsps), còn được gọi là 3CLpro, vì nó có tính tương đồng với 3Cpro của picornavirus ( 9).Những nsps này được cho là được tập hợp thành một RTC động lớn, xúc tác cho quá trình tổng hợp RNA bộ gen (sao chép) và một tập hợp RNA gen phụ (phiên mã) và được sử dụng để điều phối sự biểu hiện của ORF nằm ở hạ lưu ORF1b (10?? ?12).
RTC cốt lõi bao gồm RNA polymerase phụ thuộc RNA (RdRp) (13), helicase siêu họ 1 (HEL1) (14, 15) và một số enzyme xử lý RNA, chủ yếu được mã hóa trong ORF1b và thuộc họ coronavirus. Nó chứa nsp12-nsp16 và nsp9-nsp12 thuộc họ Arterioviridae (xem tài liệu tham khảo 10ââ 12).RdRp và HEL1 đại diện cho hai (1/5) miền được bảo tồn của virus tổ chim và có tính tương đồng với các virus RNA khác.Quá trình sao chép lõi được cho là được hỗ trợ bởi các tiểu đơn vị khác, bao gồm một số nsps nhỏ được giải phóng từ vùng carboxy-terminal (C-terminal) của pp1a, hạ lưu Mpro (coronavirus nsp5 và virus động mạch nsp4, tương ứng).Họ có sự bảo vệ dành riêng cho từng gia đình hạn chế và các hoạt động đa dạng (được xem xét trong tài liệu tham khảo 10ââ12).
Gần đây, một miền có các đặc điểm mô-đun trình tự độc đáo đã được tìm thấy ở đầu amino (đầu N) liền kề với RdRp trong tất cả các virus lồng nhau, ngoại trừ không có virus RNA nào khác (16).Dựa trên vị trí của nó và hoạt động của nucleotide transferase (nucleoside monophosphate [NMP] transferase), miền này được đặt tên là NiRAN (Nestvirus RdRp liên quan đến nucleotide transferase).Sự kết hợp miền kép của NiRAN-RdRp tạo thành nsp12 trong họ Coronaviridae và nsp9 trong họ Arterioviridae, và trong các họ Nestoviridae khác, NiRAN-RdRp dự kiến sẽ được phát hành dưới dạng nsp độc lập khỏi polyprotein của virus.Trong coronavirus, miền NiRAN chứa dư lượng ??1/450 và được kết nối với miền RdRp đầu cuối C thông qua vùng liên kết (16?19).Trong Virus viêm động mạch ngựa (EAV) (Arteriviridae), nsp9 tái tổ hợp cho thấy các hoạt động UMPylation và GMPylation phụ thuộc ion Mn2+ (tự), phụ thuộc vào ba bazơ trình tự được bảo tồn trong Nestovirus, AN, BN và CN. Các gốc trong trình tự.Trong đó N là viết tắt của NiRAN) (16).Cạnh đầu cuối N của các họa tiết này là họa tiết preAN ít bảo thủ hơn.Một số dư lượng này cũng được bảo tồn trong các protein kinase có liên quan xa, nơi chúng được chứng minh là có liên quan đến hoạt động xúc tác và liên kết nucleoside triphosphate (NTP) (20, 21).Phù hợp với quan sát này, một số dư lượng vị trí hoạt động chính trong pseudokinase SelO từ Pseudomonas syringae có thể được tập hợp với siêu phức hợp SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 được công bố gần đây.Dư lượng NiRAN của coronavirus được bảo tồn được đặt chồng lên trong cấu trúc vi mô điện tử.Protein tái tổ hợp (17).Người ta suy đoán rằng U/GMPylation (tự) được ghi lại sẽ tạo ra trạng thái nhất thời để chuyển NMP sang chất nền (hiện chưa rõ) (16), và sự tương đồng về cấu trúc giữa NiRAN và protein kinase (17, 19)) Là giả thuyết cho rằng NiRAN sửa đổi các protein khác.
Nhiều tính năng, bao gồm sự liên kết hệ thống độc đáo và duy nhất của nó với các virus lồng nhau và sự phân tách di truyền khỏi RdRp, khiến NiRAN trở thành một enzyme điều hòa quan trọng hợp lý đối với các virus lồng nhau, điều này rất quan trọng đối với sự xuất hiện và nhận dạng của chúng.Trước đây, ba chức năng có thể có liên quan đến NiRAN để điều chỉnh quá trình dịch mã hoặc sao chép/phiên mã bộ gen/gen phụ đã được gọi.Khi xem xét dữ liệu khan hiếm và không đầy đủ có sẵn tại thời điểm đó, mỗi chức năng đều có những ưu điểm và nhược điểm (16).Trong nghiên cứu này, chúng tôi mong muốn kết hợp các nghiên cứu di truyền sinh hóa và đảo ngược của các loại coronavirus đại diện cho hai chi, đồng thời đưa những phát hiện của chúng tôi vào nền tảng tiến hóa của đột biến tự nhiên của họ coronavirus, để hiểu rõ hơn về cõi Bí ẩn này.Chúng tôi báo cáo những tiến bộ lớn trong sự hiểu biết về NiRAN thông qua việc xác định các mục tiêu tự nhiên trong RTC, điều này (trong số ba giả thuyết có sẵn) góp phần vào vai trò của miền này trong việc bắt đầu quá trình tổng hợp RNA virus lồng nhau.Nghiên cứu này cũng mở ra khả năng cho các vai trò khác của NiRAN trên giao diện máy chủ virus.
Để mô tả các đặc tính enzyme của miền NiRAN liên quan đến virus corona nsp12, chúng tôi đã tạo ra một dạng tái tổ hợp của virus corona 229E (HCoV-229E) nsp12 ở E. coli, với thẻ His6 ở đầu C và kết hợp protein với [α32-P] Ủ cùng với NTP với sự có mặt của MnCl2 như được mô tả trong Vật liệu và Phương pháp.Phân tích sản phẩm phản ứng cho thấy sự hiện diện của protein được đánh dấu phóng xạ cùng di chuyển với nsp12 (106 kDa), chỉ ra rằng nsp12 coronavirus xúc tác sự hình thành các chất cộng hóa trị protein-NMP, tốt nhất là được tạo thành với uridine monophosphate (UMP) (Hình 1A) Và B).Phân tích định lượng cho thấy so với các nucleotide khác, cường độ tín hiệu khi kết hợp UMP tăng từ 2 đến 3 lần (Hình 1C).Dữ liệu này phù hợp với hoạt động transferase NMP được dự đoán của miền NiRAN của coronavirus (16), nhưng chỉ ra rằng ưu tiên nucleotide của miền NiRAN của coronavirus và virus động mạch là khác nhau.
Hoạt động tự NMPyl hóa của HCoV-229E nsp12.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) được ủ với [α-32P] NTP được chỉ định với sự có mặt của 6 mM MnCl2 trong 30 phút (xem Vật liệu và Phương pháp để biết chi tiết).Các sản phẩm phản ứng được phân tách bằng SDS-PAGE và nhuộm màu xanh lam rực rỡ của Coomassie.(B) Protein được dán nhãn phóng xạ được hiển thị bằng hình ảnh phốt pho.Vị trí của nsp12-His6 và các điểm đánh dấu khối lượng phân tử protein (tính bằng kilodalton) được hiển thị trong A và B. (C) Cường độ của tín hiệu phóng xạ (trung bình ± SEM) được xác định từ ba thí nghiệm độc lập.*P 0,05.Cường độ tín hiệu (phần trăm) có liên quan đến UTP.
Mặc dù các hoạt động của enzyme liên quan đến NiRAN đã được chứng minh là cần thiết cho sự nhân lên của EAV và SARS-CoV trong nuôi cấy tế bào (16), chức năng cụ thể của NiRAN và các mục tiêu tiềm năng vẫn chưa được xác định.Sự tương tự về cấu trúc được báo cáo gần đây giữa NiRAN và một họ protein có nếp gấp giống protein kinase (17, 22) đã thôi thúc chúng tôi kiểm tra giả thuyết rằng NiRAN xúc tác cho quá trình NMPylation của các protein khác.Chúng tôi đã tạo ra một tập hợp các mục tiêu tương đồng tiềm năng, bao gồm các protein phi cấu trúc được mã hóa bởi HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10), mỗi mục tiêu chứa thẻ His6 đầu C (phụ lục SI, Bảng S1) và ủ các protein này với [α32-P] uridine triphosphate ([α32-P]UTP) khi có hoặc không có mặt nsp12.Albumin huyết thanh bò và protein tổng hợp MBP-LacZα được sản xuất ở E. coli được dùng làm đối chứng (Hình 2A, làn 1 đến 7).Protein được đánh dấu phóng xạ được phân tích bằng phương pháp điện di trên gel natri dodecyl sulfate-polyacrylamide (SDS-PAGE) và ghi tự động, người ta phát hiện ra rằng có tín hiệu phóng xạ mạnh trong phản ứng có chứa nsp12 và nsp9.Vị trí của tín hiệu tương ứng với khối lượng phân tử của nsp9, biểu thị UMPylation qua trung gian nsp12 của nsp9 (Hình 2B, rãnh 7).Không có protein thử nghiệm nào khác được phát hiện là UMPylat, điều này khiến chúng tôi kết luận rằng nsp9 là chất nền cụ thể của nsp12.Phù hợp với dữ liệu tự NMPylation được hiển thị trong Hình 1, nsp12 có thể chuyển cả 4 NMP sang nsp9, mặc dù hiệu quả là khác nhau, UMP> adenosine monophosphate (AMP)> guanosine monophosphate (GMP)> cytidine monophosphate (CMP)) ( Hình ảnh).3 A và B).Trong các điều kiện được sử dụng trong xét nghiệm này (rút ngắn thời gian phản ứng và phơi nhiễm, giảm nồng độ nsp12; vật liệu và phương pháp), không thể phát hiện khả năng tự NMPylation của nsp12 (so sánh Hình 2B, làn 7 và Hình 1B), điều này đã chứng minh một UMP hiệu quả (Và nhiều vòng) đã chuyển từ nsp12 sang nsp9.Hoạt động enzym chuyển UMP yêu cầu sự có mặt của các ion Mn2+, như được thể hiện trong Hình 3C, trong khi chỉ quan sát thấy hoạt động chuyển gen UMP tối thiểu khi có mặt Mg2+, và không có hoạt động nào khi có mặt hai cation hóa trị hai khác được thử nghiệm.Dữ liệu tương tự thu được trong các thử nghiệm NMPylation chứa cytidine triphosphate (CTP), guanosine triphosphate (GTP) và adenosine triphosphate (ATP) (phụ lục SI, Hình S1).
UMPylation qua trung gian HCoV-229E nsp12 của nsp9.Một loạt cơ chất protein (bao gồm albumin huyết thanh bò, MBP-lacZα và một loạt nsps HCoV-229E được dán nhãn C-terminal His6 được mã hóa bởi ORF1a) đã được sử dụng để đánh giá hoạt động UMPylation của HCoV-229E nsp12-His6⁺ qua trung gian chất đạm.Ủ protein với [α-32P] UTP trong 10 phút khi không có (A) hoặc có mặt (B) nsp12 như được mô tả trong tài liệu và phương pháp.Ở phía trên của A và B, gel SDS-polyacrylamide được nhuộm bằng Coomassie Brilliant Blue được hiển thị, và ở dưới cùng của A và B, các biểu đồ tự động tương ứng được hiển thị.Vị trí của chất đánh dấu khối lượng phân tử protein (tính bằng kilodalton) được đưa ra ở bên trái.Vị trí của nsp12-His6 (B, trên cùng) và tín hiệu phóng xạ quan sát được trong quá trình ủ nsp12-His6 với nsp9-His6 (B, làn 7) cũng được chỉ định, điều này cho thấy rằng [α-32P]UMP đến nsp9-His6 (12,9 kDa), điều này không được quan sát thấy đối với các protein khác được thử nghiệm.
HCoV-229E Đặc tính sinh hóa và virus qua trung gian NiRAN của nsp9 NMPylation.(A và B) Vai trò của đồng cơ chất nucleotide được sử dụng trong phản ứng.Nsp12-His6 và nsp9-His6 được trộn và ủ với sự có mặt của các NTP [α-32P] khác nhau trong xét nghiệm NMPylation tiêu chuẩn.(A, trên cùng) nsp9-His6 nhuộm màu Coomassie được phân tách bằng SDS-PAGE.(A, phía dưới) Máy chụp X quang tự động của cùng một khu vực trên gel.(B) Hoạt tính tương đối (trung bình ± SEM) với sự có mặt của đồng yếu tố nucleotide được chỉ định được xác định từ ba thí nghiệm độc lập.*P 0,05.(C) Vai trò của các ion kim loại.Trên đây là thử nghiệm NMPylation tiêu chuẩn với sự có mặt của [α-32P] UTP và các ion kim loại khác nhau, mỗi ion có nồng độ 1 mM.Trong C, phía trên, Coomassie nhuộm màu nsp9-His6 được hiển thị và ở C, phía dưới, bản ghi tự động tương ứng được hiển thị.Kích thước của protein được dán nhãn (tính bằng kilodalton) được hiển thị ở bên trái của A và C. (D) Dạng đột biến của HCoV-229E nsp12-His6 mang sự thay thế axit amin được chỉ định là trong [α-32P]UTP, như được mô tả trong Vật liệu và Phương pháp.Nsp9-His6 được dán nhãn phóng xạ được tạo ra trong phản ứng NMPylation được phát hiện bằng hình ảnh phosphoryl hóa (D, trên cùng).Hoạt tính tương đối so với protein loại hoang dã (wt) được hiển thị bằng D và phần dưới được lấy làm mức trung bình (± SEM) từ ba thí nghiệm Độc lập.Dấu hoa thị biểu thị sự thay thế của dư lượng không được bảo tồn.(E) Hiệu giá vi rút trong bề mặt nuôi cấy của tế bào p1 thu được 24 giờ sau khi nhiễm bệnh được xác định bằng xét nghiệm mảng bám.Các sự thay thế codon trong miền NiRAN của đột biến HCoV-229E được thiết kế đã được chỉ định (việc đánh số dư lượng dựa trên vị trí của chúng trong pp1ab).Trình đột biến trang hoạt động RdRp thiếu khả năng sao chép nsp12_DD4823/4AA đã được sử dụng làm đối chứng.
Để hiểu sâu hơn về vị trí hoạt động của NiRAN và xác định các dư lượng liên quan đến hoạt động của NMP transferase đặc hiệu nsp9, chúng tôi đã thực hiện phân tích đột biến, trong đó chúng tôi thay thế các dư lượng bảo thủ trong các họa tiết NiRAN AN, BN và CN ( 16) Đó là Ala (phụ lục SI, Hình S2).Ngoài ra, tác động của việc thay thế Arg-to-Lys hoặc Lys-to-Arg bảo thủ đã được đánh giá trong hai trường hợp.Như một biện pháp kiểm soát (âm tính), các dư lượng không được bảo tồn hoặc ít được bảo tồn trong miền NiRAN của vi-rút corona và các vi-rút lồng nhau khác được thay thế bằng Ala. Thay thế K4116A (trong họa tiết preAN), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (mô-đun BN) và D4280A (CN) làm giảm đáng kể hoặc thậm chí loại bỏ nsp9 NMPylation thông qua nsp12, trong khi các protein có sự thay thế bảo thủ (R4178K), K4116R) giữ lại 60% và 80% hoạt động của chúng, điều này cho thấy rằng việc nới lỏng các hạn chế ở phía tương ứng của chúng chuỗi nhạy cảm về mặt hóa lý (Hình 3D).Việc thay thế một số dư lượng được bảo tồn khác E4145A, D4273A, F4281A và D4283A ít gây hại hơn nhiều và nsp9 UMPylation chỉ giảm ở mức độ vừa phải.Các kết quả tương tự cũng thu được trong các phản ứng NMPylation nsp9 liên quan đến các NTP khác (Hình 3D và phụ lục SI, Hình S3), xác nhận rằng các tác động quan sát được đối với sự thay thế axit amin cụ thể là không phụ thuộc vào loại cơ chất nucleotide được sử dụng.Tiếp theo, chúng tôi đã thử nghiệm tác động có thể có của những thay thế nsp12 này đối với sự nhân lên của vi rút Corona trong nuôi cấy tế bào.Để đạt được mục đích này, chúng tôi đã sử dụng các mẫu DNA bổ sung được biến đổi gen (cDNA) thích hợp được nhân bản trong virus vaccinia tái tổ hợp (23, 24) để phiên mã 5 -7 tế bào.Việc chuẩn độ thế hệ virus truyền nhiễm được tạo ra trong các tế bào này cho thấy hầu hết các đột biến HCoV-229E NiRAN đều không khả thi (Hình 3E).Một nhóm các đột biến virus không thể sống được bao gồm các chất thay thế đã được chứng minh là loại bỏ hoặc làm giảm đáng kể hoạt động của NMP transferase trong ống nghiệm (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), nhưng có hai chất thay thế khác (K4116R, E4145A) 80 % kín đáo?Hoạt động NMPylation trong ống nghiệm của họ cho thấy có những hạn chế bổ sung.Tương tự, hai đột biến khác (R4178K, F4281A) làm giảm vừa phải hoạt động NMPylation trong ống nghiệm của NiRAN tạo ra virus sống, tuy nhiên, những virus này làm giảm đáng kể hiệu giá thông qua quá trình sao chép.Phù hợp với dữ liệu hoạt động in vitro được hiển thị trong Hình 3D, việc thay thế bốn dư lượng khác không được bảo tồn trong vi-rút corona và/hoặc các vi-rút lồng nhau khác (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) đã tạo ra các vi-rút khả thi. hiệu giá giảm vừa phải so với virus hoang dại (Hình 3E).
Để nghiên cứu xem hoạt động transferase NMP qua trung gian NiRAN có phụ thuộc vào miền RdRp đang hoạt động hay không, hai gốc Asp được bảo tồn liên quan đến sự phối hợp của các ion kim loại hóa trị hai (11) trong mô típ RdRp C đã được thay thế bằng Ala. Protein thu được là nsp12_DD4823/4AA được giữ lại Hoạt động NMPylation nsp9 của nó, chỉ ra rằng hoạt động NMPylation nsp9 in vitro qua trung gian nsp12 không yêu cầu hoạt động polymerase (Phụ lục SI, Hình S4).
Sau khi thiết lập hoạt động transferase NMP đặc hiệu nsp9 cho nsp12, chúng tôi đã cố gắng mô tả đặc điểm cộng NMP-nsp9 bằng phép đo phổ khối (MS).Phổ khối protein hoàn chỉnh của HCoV-229E nsp9 tái tổ hợp cho thấy đỉnh ở mức 12.045 Da (Hình 4A).Việc bổ sung nsp12 không làm thay đổi chất lượng của nsp9, cho thấy rằng nsp12 và nsp9 sẽ không tạo thành phức hợp ổn định trong các điều kiện được sử dụng (biến tính) (Hình 4A).Với sự có mặt của UTP và GTP, phép đo khối lượng của phản ứng chứa nsp9 và nsp12 lần lượt cho thấy khối lượng protein của UTP di chuyển 306 Da và khối lượng protein của GTP di chuyển 345 Da, chứng tỏ mỗi phân tử nsp9 liên kết với một UMP hoặc GMP (Hình 4) C và D).Người ta suy đoán rằng năng lượng cần thiết cho quá trình NSP9 NMPylation qua trung gian NiRAN đến từ quá trình thủy phân NTP và giải phóng pyrophosphate.Mặc dù lượng nsp9 (đích) vượt quá 10 lần so với nsp12 (enzym) đã được sử dụng trong phản ứng này, nhưng người ta đã quan sát thấy NMPylation gần như hoàn toàn của nsp9, cho thấy rằng sự tương tác giữa nsp12 và nsp9 chỉ tồn tại trong thời gian ngắn và nsp12 có thể NMPylate nhiều nsp9 hơn phân tử in vitro.
NMPylation đơn của nsp9 với sự có mặt của nsp12 và UTP hoặc GTP.Hiển thị là phổ khối protein hoàn chỉnh đã được giải mã của HCoV-229E nsp9 (phụ lục SI, Bảng S1) (AD).(A) riêng nsp9, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 với sự có mặt của UTP, (D) nsp9 + nsp12-His6 với sự có mặt của GTP.
Để xác định dư lượng nsp9 UMPylat bởi nsp12, nsp9-UMP được phân cắt bằng trypsin.Các peptide thu được được phân tách bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao nano (HPLC) và được phân tích trực tuyến bằng phép đo khối phổ song song (MS/MS).Phân tích dữ liệu bằng gói phần mềm Byonic (Số liệu Protein) cho thấy UMPyl hóa axit amin đầu N.Điều này được xác nhận bằng tay.Phổ khối song song của peptide tiền chất [UMP] NNEIMPGK (phụ lục SI, Hình S5A) cho thấy một đoạn ở tốc độ 421 m/z, cho thấy UMP liên kết với dư lượng 1 của nsp9.
Tại đầu N của nsp9, Asn được bảo tồn trong số các thành viên của Orthocoronavirinae (phụ lục SI, Hình S6).Mặc dù chúng tôi tin rằng nitơ amin sơ cấp ở đầu N là chất có khả năng chấp nhận UMP nhất, chúng tôi đã quyết định thu thập thêm bằng chứng về liên kết NMP ở đầu N.Vì lý do này, peptit đầu cuối N không NMPylat và NMPylat được tinh chế bằng HPLC được tạo ra với sự có mặt của axeton và natri cyanoborohydrua.Trong những điều kiện này, chỉ các amin bậc một tự do mới có thể được biến tính bằng propyl (25).Peptide có nguồn gốc từ N-terminal nsp9 có trình tự NNEIMPGK chứa hai amin chính, một ở đầu N của Asn và một ở chuỗi bên của Lys ở đầu C.Do đó, nhóm propyl có thể được đưa vào ở cả hai đầu.Sắc ký đồ ion chiết của các peptide không NMPylat được trình bày trong phụ lục SI, Hình S5B.Đúng như mong đợi, có thể xác định được propylated ở đầu N và đầu C (mono) (phụ lục SI, Hình S5B, làn trên) và peptide dipropylated (phụ lục SI, Hình S5B, làn dưới).Mẫu này thay đổi khi sử dụng peptide N-terminal NMPylat của nsp9.Trong trường hợp này, chỉ có thể xác định được peptide propyl hóa ở đầu C, nhưng không xác định được peptide propyl hóa ở đầu N và peptide dipropyl hóa (Phụ lục SI, Hình S5C), cho thấy rằng UMP đã được chuyển sang amin chính ở đầu N để ngăn chặn điều này nhóm thực hiện các thay đổi.
Tiếp theo, chúng tôi thay thế (bằng Ala hoặc Ser) hoặc xóa phần dư được bảo toàn tại điểm cuối N của nsp9 để xác định các ràng buộc dành riêng cho mục tiêu.Dựa trên dữ liệu MS của chúng tôi cho thấy NiRAN tạo thành một chất bổ sung nsp9-NMP với amin chính của dư lượng đầu cuối N của nsp9, chúng tôi đã đưa ra giả thuyết rằng nsp9 NMPylation yêu cầu protease chính của virus (Mpro, nsp5) để giải phóng đầu cuối N nsp9 từ tiền chất polyprotein của nó.Để kiểm tra giả thuyết này, chúng tôi đã tạo ra protein tiền thân nsp7-11 chứa nsp9 trong E. coli và thực hiện thử nghiệm NMPylation tiêu chuẩn với sự có mặt của [α-32P] UTP (vật liệu và phương pháp).Như được hiển thị trong Hình 5A (làn 3), tiền thân nsp7-11 chưa được cắt không được dán nhãn phóng xạ bằng nsp12.Ngược lại, nếu nsp7-11 bị phân cắt bởi nsp5 tái tổ hợp để giải phóng nsp9 (và các nsps khác) khỏi tiền chất, thì một protein được đánh dấu phóng xạ di chuyển cùng với nsp9 sẽ được phát hiện, xác nhận kết luận của chúng tôi rằng NiRAN và N- Sự hình thành có chọn lọc của các chất cộng hóa trị nsp9-NMP .Amin bậc một cuối cùng của đầu N Asn (vị trí 3825 trong pp1a/pp1ab).Kết luận này cũng được hỗ trợ bởi các thí nghiệm sử dụng cấu trúc nsp9, cấu trúc này chứa một hoặc hai gốc bổ sung tại đầu N.Trong cả hai trường hợp, UMPylation qua trung gian NiRAN của nsp9 đều bị bãi bỏ (Phụ lục SI, Hình S7).Tiếp theo, chúng tôi tạo ra một protein có một hoặc hai gốc Asn bị xóa khỏi chuỗi peptide 3825-NNEIMPK-3832 ở đầu N của nsp9.Trong cả hai trường hợp, nsp9 UMPylation đã bị chặn hoàn toàn (Hình 5B), cung cấp thêm bằng chứng cho thấy đầu Nsp9 thực sự hoạt động như một thụ thể NMP.
Quá trình phân giải protein của nsp9 và vai trò của dư lượng đầu cuối N trong UMPylation qua trung gian nsp12.(A) nsp9 UMPylation yêu cầu thiết bị đầu cuối Nsp9 miễn phí.Nsp7-11-His6 được ủ trước ở 30°C trong bộ đệm phát hiện NMPylation có chứa UTP khi có hoặc không có Mpro tái tổ hợp (nsp5-His6).Sau 3 giờ, bắt đầu xét nghiệm NMPylation bằng cách thêm nsp12-His6 như mô tả trong Vật liệu và Phương pháp.Phản ứng chứa nsp5-His6 (làn 1) và nsp9-His6 (làn 2) được sử dụng làm đối chứng.Sau 10 phút, phản ứng kết thúc và hỗn hợp phản ứng được phân tách bằng SDS-PAGE.Protein được nhuộm bằng Coomassie Brilliant Blue (A, trên cùng).Tiền chất Nsp7-11-His6 và sản phẩm được xử lý do sự phân tách qua trung gian nsp5-His6 được hiển thị bên phải.Xin lưu ý (do kích thước nhỏ của chúng) rằng nsp7 và nsp11-His6 không thể phát hiện được trong gel này và phản ứng được bổ sung nsp5-His6 (làn 1 và 4; vị trí của nsp5-His6 được biểu thị bằng một vòng tròn liền nét) hoặc nsp9-His6 (Ngõ 2) chứa một lượng nhỏ MBP (được biểu thị bằng các vòng tròn mở) dưới dạng tạp chất còn sót lại vì chúng được biểu thị dưới dạng protein tổng hợp MBP (phụ lục SI, Bảng S1).(B) Biến thể Nsp9-His6 thiếu một hoặc hai gốc Asn đầu N (đánh số dư lượng theo vị trí trong pp1a/pp1ab) và được tinh chế và ủ với nsp12-His6 và [α-32P] UTP.B, SDS-PAGE được nhuộm bằng Coomassie được hiển thị ở trên cùng, B, máy ghi tự động tương ứng được hiển thị ở phía dưới.Vị trí của điểm đánh dấu trọng lượng phân tử (tính bằng kilodalton) được hiển thị bên trái.(C) HCoV-229E nsp9-His6 Phần dư được bảo tồn ở đầu N được thay thế bằng Ala hoặc Ser, và cùng một lượng protein đã được sử dụng trong phản ứng UMPylation qua trung gian nsp12-His6.Các sản phẩm phản ứng được phân tách bằng SDS-PAGE và nhuộm màu Coomassie Brilliant Blue (C, trên cùng) và nsp9-His6 được dán nhãn phóng xạ được phát hiện bằng hình ảnh lân quang (C, giữa).Sử dụng protein loại hoang dã (wt) làm tham chiếu (được đặt thành 100%), hoạt động NMPylation tương đối (trung bình ± SEM) được tính toán từ ba thí nghiệm độc lập.(D) Hiệu giá vi-rút trong bề mặt nuôi cấy tế bào p1 của tế bào Huh-7 bị nhiễm tế bào Huh-7 hoang dã HCoV-229E và các đột biến mang chất thay thế axit amin được chỉ định trong nsp9 được xác định bằng xét nghiệm mảng bám.Mô-đun RdRp đột biến kép C DD4823/4AA thiếu khả năng sao chép được sử dụng làm đối chứng âm.
Đầu N của nsp9 (đặc biệt là vị trí 1, 2, 3 và 6) được bảo tồn rất tốt trong số các thành viên của phân họ Orthocoronavirinae (phụ lục SI, Hình S6).Để nghiên cứu vai trò có thể có của các dư lượng này trong Nsp9 NMPylation qua trung gian nsp12, hai dư lượng Asn liên tiếp tại đầu N của nsp9 đã được thay thế bằng Ala hoặc Ser (một mình hoặc kết hợp).So với nsp9 kiểu hoang dã, việc thay thế N3825 bằng Ala hoặc Ser đã dẫn đến giảm hơn hai lần UMPylation qua trung gian nsp12 (Hình 5C).Phù hợp với kết luận của chúng tôi rằng NMPylation xảy ra ở amin chính đầu N thay vì chuỗi bên của dư lượng đầu N, chúng tôi đã quan sát thấy NMPylation dư đáng kể khi thay thế N3825A và N3825S.Điều thú vị là nếu thay thế Asn thứ hai bằng Ala hoặc Ser thì UMPylation của nsp9 bị giảm mạnh hơn (hơn 10 lần), trong khi việc thay thế Ala ở các vị trí 3, 4 và 6 chỉ có tác dụng vừa phải đối với nsp9 UMPylation (Hình 2). ) .5C).Các kết quả tương tự cũng đạt được khi sử dụng ATP, CTP hoặc GTP (phụ lục SI, Hình S8).Nói chung, các dữ liệu này chỉ ra vai trò chính của N2826 (vị trí 2 trong nsp9) trong nsp9 NMPylation.
Để có thêm bằng chứng về mối tương quan chức năng giữa đầu N của nsp9 và NMPylation, chúng tôi đã thực hiện căn chỉnh nhiều chuỗi (MSA) của trình tự nsp9 thuộc họ Corona (thay đổi từ 104 đến 113 gốc) (SI Phụ lục, Hình S6 ).Tổng cộng, trong 47 loài (đã biết và giả định) thuộc 5 chi thuộc phân họ Orthocoronavirinae lây nhiễm các loài động vật có vú, chim và vật chủ bò sát khác nhau, chỉ có tổng cộng 8 tàn dư được phát hiện là bất biến.Những thay đổi sâu rộng nhất, bao gồm cả việc xóa và thêm vào, được quan sát thấy trong các chu kỳ giữa các thành phần cấu trúc thứ cấp của nsp9, như được xác định bởi các nghiên cứu cấu trúc trước đó (26 ??28).Năm dư lượng bất biến đã được tìm thấy trong chuỗi β và chuỗi xoắn α của phần đầu C của nsp9.Ba dư lượng bất biến tạo thành mô-đun NNE của đầu N của nsp9.Người ta tiết lộ rằng Asn thứ hai của mô típ này là dư lượng bất biến duy nhất, cũng được chia sẻ bởi nsp9 giả thuyết của loài ếch coronavirus có liên quan xa và đại diện cho loài Microhyla letovirus 1 trong phân họ Letovirinae của Alphaletovirus.Việc bảo tồn dư lượng trong các phần tử cấu trúc thứ cấp nsp9 có thể được hợp lý hóa bằng cách xem xét cấu trúc để duy trì các đặc tính liên kết gấp hoặc đã biết của RNA.Tuy nhiên, lý do này dường như không áp dụng cho việc bảo tồn NNE và trước nghiên cứu này, bản chất của các ràng buộc hạn chế sự biến đổi của trình tự tripeptide đã bị che khuất hoàn toàn.
Để xác định tầm quan trọng của việc bảo tồn nsp9-NMPylation và NNE trong quá trình sao chép của coronavirus, chúng tôi đã tạo ra các đột biến HCoV-229E, mang các thay thế đơn hoặc kép của dư lượng đầu cuối N của nsp9, cho thấy rằng nsp9 NMPylation có hại trong ống nghiệm.Trước khi bắt đầu, chúng tôi cố gắng trả lời câu hỏi liệu những sự thay thế này (gần vị trí phân cắt nsp8|9) có ảnh hưởng đến quá trình phân giải protein của vùng pp1a C-terminal hay không.Một tập hợp các cấu trúc polyprotein nsp7-11 chứa các chất thay thế tương ứng ở đầu N của nsp9 được tạo ra ở E. coli và được cắt bằng Mpro tái tổ hợp.Sự phân cắt protein của bốn vị trí (bao gồm cả vị trí sườn nsp9) không bị ảnh hưởng đáng kể bởi bất kỳ sự thay thế nào được đưa vào (phụ lục SI, Hình S9), ngoại trừ những thay đổi cấu trúc trong các protein này cản trở sự phân cắt nsp8|9 qua trung gian Mpro ( Hoặc khác) trang mạng.
Các tế bào Huh-7 đã được thay thế bằng RNA HCoV-229E có chiều dài bộ gen, mã hóa các chất thay thế Ala hoặc Ser trong các tripeptide NNE được bảo tồn (N3825, N3826 và E3827) tại đầu cuối nsp9 N, cho thấy hầu hết các đột biến đều gây tử vong.Chúng tôi đã có thể giải cứu vi-rút bằng cách thay thế Ser hoặc Ala của N-terminal Asn (N2835A hoặc N2835S), nhưng không thể phục hồi vi-rút bằng các đột biến đơn và kép khác trong trình tự NNE (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS), E3827A) (Hình 5D).
Những kết quả này chỉ ra rằng sự nhân lên của vi rút Corona trong nuôi cấy mô bị hạn chế (giống hoặc tương tự), hạn chế sự đột biến tự nhiên của các vị trí NMPylation nsp9 trong cơ thể và hỗ trợ vai trò chính của phản ứng này trong vòng đời của vi rút Corona.
Trong tập thí nghiệm cuối cùng, chúng tôi đã tạo ra His6 có nhãn SARS-CoV-2 nsp12 và nsp9, cùng hai dạng đột biến của nsp12 ở E. coli.Thay vào đó, phần còn lại của trang hoạt động trong miền NiRAN và RdRp lần lượt được sử dụng Ala (Hình 6A và phụ lục SI, Bảng S2).K4465 trong SARS-CoV-2 nsp12 tương ứng với K4135 trong HCoV-229E (Phụ lục SI, Hình S2), được chứng minh là cần thiết cho hoạt động NiRAN và sao chép HCoV-229E (Hình 3D và E).Dư lượng này cũng tương ứng với dư lượng EAV nsp9 K94 của virus động mạch, trước đây được chứng minh là cần thiết cho quá trình tự UMPyl hóa/tự GMPylation của NiRAN (16).Như được hiển thị trong Hình 6B, SARS-CoV-2 nsp12 có hoạt động UMP transferase sử dụng nsp9 làm cơ chất, trong khi đột biến vị trí hoạt động nsp12_K4465A không hoạt động.Sự thay thế kép trong chuỗi đặc tính SDD của mô-đun RdRp C không ảnh hưởng đến hoạt động transferase UMP (Hình 6B), chỉ ra rằng hoạt động RdRp không có tác dụng trực tiếp trong nsp9 UMPylation.Dữ liệu tương tự được lấy bằng CTP, GTP và ATP (phụ lục SI, Hình S10).Tóm lại, những dữ liệu này chỉ ra rằng nsp9 NMPylation qua trung gian NiRAN có hoạt động bảo tồn ở các coronavirus đại diện cho các chi khác nhau của phân họ orthocoronavirus.
NMPylation qua trung gian SARS-CoV-2 nsp12 của nsp9.(A) Gel SDS-polyacrylamide nhuộm màu Coomassie cho thấy protein tái tổ hợp được sử dụng trong thử nghiệm NMPylation.Để kiểm soát, một protein đột biến có khả năng thay thế vị trí hoạt động trong miền NiRAN (K4465A) và miền RdRp (DD5152/3AA) của SARS-CoV-2 nsp12 đã được sử dụng.Việc đánh số dư lượng dựa trên vị trí trong pp1ab.(B) Máy ghi tự động phát hiện UMPylation sử dụng nsp9-His6 và [α-32P]UTP làm cơ chất của nsp12-His6 (loại hoang dã [wt] và đột biến).Khối lượng phân tử (tính bằng kilodalton) của protein được dán nhãn được hiển thị bên trái.
Các miền NiRAN thường được bảo tồn ở Nidovirales (16), cho thấy rằng chúng xúc tác các phản ứng enzyme cần thiết cho sự sao chép của Nidovirus.Trong nghiên cứu này, chúng tôi có thể chứng minh rằng miền NiRAN của coronavirus chuyển NMP (được tạo từ NTP) sang nsp9, một protein liên kết RNA bí ẩn liên quan đến quá trình sao chép của virus (26 ?? 29), để xác định nó là mục tiêu tự nhiên và đối tác của coronavirus RTC.
Miền NiRAN chia sẻ ba mô-đun trình tự (AN, BN và CN), chứa một số lượng rất nhỏ các gốc được bảo tồn trong tất cả các họ theo thứ tự Nidovirales đơn ngành nhưng có tính khác biệt cao (8, 16).Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng chúng có liên quan về mặt cấu trúc với một họ protein giống protein kinase không có đặc tính, ban đầu được gọi là họ SelO (17, 19, 22, 30, 31).Các protein liên quan đến SelO có các nếp gấp kinase, nhưng thiếu một số vị trí hoạt động được bảo tồn trong các kinase cổ điển (22, 32).Dựa trên sự định hướng ngược của các phân tử ATP liên kết với vị trí hoạt động và được ổn định bằng các tương tác cụ thể, SelO đã được đưa ra giả thuyết và sau đó được xác nhận là chuyển AMP (thay vì photphat) sang cơ chất protein (22), trong khi một protein giống SelO khác của vi khuẩn là YdiU có gần đây đã được chứng minh là xúc tác cho sự gắn kết cộng hóa trị của UMP với Tyr và dư lượng của His trên các cơ chất protein khác nhau (33).
Để xác nhận và mở rộng dự đoán về dư lượng vị trí hoạt động giả định của miền NiRAN của coronavirus, chúng tôi đã sử dụng các phương pháp di truyền sinh hóa và di truyền ngược để thực hiện phân tích đột biến trên coronavirus nsp12 (Hình 3D và E và phụ lục SI, Hình S3 và bảng) S1â S4).Dữ liệu cho thấy rằng việc thay thế HCoV-229E K4135, R4178 và D4280 bằng Ala giúp loại bỏ hoạt động của NMP transferase in vitro và sự nhân lên của virus trong nuôi cấy tế bào (Hình 3D và E và các phụ lục SI, Hình S3), hỗ trợ sự hiện diện của chúng trong NTP γ-phosphate (K4135, R4178) và sự phối hợp của các ion kim loại tại vị trí hoạt động (D4280).Sự thay thế E4145A của Glam được bảo tồn trong phạm vi của vi rút tổ chim được dự đoán là sẽ ổn định vị trí K4135 (17) đã được chứng minh là loại bỏ sự nhân lên của vi rút, nhưng đáng ngạc nhiên là hoạt tính này vẫn được giữ lại trong xét nghiệm NMPylation in vitro (Hình 3D và E và Phụ lục SI, Hình S3 và Bảng S1–S4).Quan sát tương tự được thực hiện khi chất thay thế tương ứng được đưa vào chất tương đồng YdiU của Salmonella typhimurium (E130A) (33).Kết hợp lại với nhau, những dữ liệu này hỗ trợ chức năng điều tiết của dư lượng được bảo tồn này hơn là chức năng xúc tác.
Việc thay thế dư lượng Phe được bảo tồn (F4281A) trong phạm vi của Nestovirus trong miền HCoV-229E NiRAN (8) dẫn đến giảm hoạt động NMPylation trong ống nghiệm và giảm đáng kể khả năng nhân lên của virus trong nuôi cấy tế bào (Hình 3D, E và SI) phụ lục, Hình S3).Dữ liệu phù hợp với chức năng điều tiết quan trọng của dư lượng này, chẳng hạn như dư lượng Phe mô-đun DFG tương đồng được trình bày trước đây.Trong các protein kinase cổ điển, nó là một phần của vòng liên kết Mg2+ và giúp tập hợp và điều hòa cột sống???Cần thiết cho hoạt động xúc tác hiệu quả (32, 34).Việc thay thế Ala và Arg cho dư lượng K4116 (trong mô típ preAN), tương ứng, đã loại bỏ sự nhân lên của virus và, như mong đợi, có tác dụng khác nhau đối với hoạt động của NMP transferase trong ống nghiệm, tùy thuộc vào chuỗi bên axit amin được giới thiệu (Hình 3D và phụ lục E và SI , Hình S3).Dữ liệu chức năng phù hợp với thông tin cấu trúc, chỉ ra rằng dư lượng này đã thiết lập sự tương tác với ATP phosphate (17).Trong miền NiRAN của các họ vi rút lồng nhau khác, vị trí của HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 do Lys, Arg hoặc His (8) chiếm giữ, cho thấy hạn chế về chức năng của dư lượng cụ thể này đã được nới lỏng.Việc thay thế D4188A và D4283A sẽ loại bỏ hoặc làm giảm mạnh hoạt động của enzyme và loại bỏ sự nhân lên của virus (Hình 3).Hai dư lượng này được bảo tồn trong hầu hết (nhưng không phải tất cả) các virus lồng nhau (8), cho thấy một chức năng quan trọng dành riêng cho họ nhưng có thể không có chức năng xúc tác.Sự thay thế Ala của một số dư lượng Lys và Asp khác (K4113A, D4180A, D4197A và D4273A) không được bảo tồn trong họ Coronaviridae hoặc các họ Nestioviridae khác (8) đã được sử dụng làm đối chứng.Đúng như dự đoán, những sự thay thế này phần lớn có thể chấp nhận được, với hoạt tính của enzyme và sự nhân lên của virus giảm nhẹ trong một số trường hợp (Hình 3 và phụ lục SI, Hình S3).Nhìn chung, dữ liệu gây đột biến virus corona rất phù hợp với dữ liệu di truyền ngược và tự GMP của EAV NiRAN-RdRp (16), trong đó EAV nsp9 (coronavirus nsp12 ortholog) tồn dư K94 (tương ứng với HCoV-229E K4135) có chức năng quan trọng), R124 (tương ứng với R4178), D132 (tương ứng với D4188), D165 (tương ứng với D4280), F166 (tương ứng với F4281).Ngoài ra, dữ liệu gây đột biến HCoV-229E phù hợp và được mở rộng từ dữ liệu di truyền ngược SARS-CoV đã được báo cáo trước đó (16), rất giống với dữ liệu được quan sát đối với mô-đun CN tương ứng Đột biến Phe-to-Ala SARS-CoV_nsp12. kiểu hình được mô tả -F219A và HCoV-229E_F4281A (Hình 3 D và E và phụ lục SI, Hình S3 và Bảng S1-S4).
So với các chỉnh hình EAV (16), có sự ưu tiên rõ ràng đối với UTP và GTP (trong phản ứng tự NMPylation), nghiên cứu của chúng tôi cho thấy rằng miền NiRAN của coronavirus (đại diện là HCoV-229E và SARS-CoV-2) có thể hoạt động hiệu quả đã chuyển Tất cả bốn NMP, mặc dù có một chút ưu tiên cho UMP (Hình 1 và 3).Độ đặc hiệu tương đối thấp của đồng cơ chất NTP cụ thể phù hợp với cấu trúc siêu tổng hợp SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 được báo cáo gần đây, trong đó ADP-Mg2+ liên kết với vị trí hoạt động của NiRAN, nhưng không liên kết với Phần adenine của sự hình thành các tương tác cụ thể (17).Trong nghiên cứu của chúng tôi, loại nucleotide được sử dụng trong phản ứng NMPylation không có tác động khác biệt đến hoạt động của protein đột biến (Phụ lục SI, Hình S3), cho thấy rằng không có dư lượng nào trong số này có liên quan chặt chẽ với sự liên kết của một nucleobase cụ thể.Cơ sở cấu trúc và ý nghĩa sinh học tiềm tàng của các ưu tiên đồng cơ chất NTP khác nhau được quan sát thấy trong miền NiRAN của coronavirus và virus động mạch vẫn đang được nghiên cứu;chúng có thể đúng hoặc có thể là do những hạn chế của nghiên cứu tương ứng của chúng.Hiện tại, không thể loại trừ rằng hoạt động NMPylator tiềm năng của miền NiRAN của virus động mạch (so với hoạt động tự NMPylation đặc trưng trước đó) có ưu tiên đồng cơ chất khác, có tính đến sự giống nhau giữa động mạch và coronavirus Miền NiRAN đang ở giới hạn.So sánh dựa trên trình tự (16).So với pseudokinase SelO, sử dụng Mg2+ làm đồng yếu tố, hoạt động của coronavirus và virus động mạch NiRAN phụ thuộc vào Mn2+ (16) (Hình 3C và phụ lục SI, Hình S1).Sự phụ thuộc Mn2+ và sự ưu tiên rõ ràng đối với UTP là một đặc điểm bất thường của NMPylators protein và gần đây mới được xác nhận trong protein YdiU của Salmonella typhimurium, chất này xúc tác cho UMPylation protein phụ thuộc Mn2+ nghiêm ngặt để bảo vệ tế bào khỏi cảm ứng căng thẳng Nhóm ATP tế bào ( 33).
Sự tương tự về cấu trúc được mô tả gần đây giữa miền NiRAN của coronavirus và kinase protein của tế bào (17, 19) cung cấp hỗ trợ bổ sung cho khả năng của NiRAN trong việc liên kết cộng hóa trị NMP với các protein khác mà chúng tôi đã báo cáo trong nghiên cứu này.Chúng tôi tập trung tìm kiếm các mục tiêu NiRAN khả thi trên các protein được mã hóa bởi HCoV-229E ORF1a, được biết là hỗ trợ trực tiếp hoặc gián tiếp quá trình sao chép được mã hóa ORF1b của RTC (12, 35).Các thí nghiệm của chúng tôi cung cấp bằng chứng thuyết phục về NMPylation hiệu quả và cụ thể của nsp9 (Hình 2).Nếu protein mục tiêu được sử dụng với lượng vượt quá mol cao hơn từ 8 đến 10 lần so với enzyme (nsp12), thì khẳng định rằng nsp9 hoàn toàn (mono)NMPized (Hình 4).Chúng tôi kết luận rằng sự tương tác giữa nsp12 và nsp9 chỉ tồn tại trong thời gian ngắn và sẽ không tạo thành phức hợp ổn định với nsp9 (trong trường hợp không có các tiểu đơn vị RTC khác).Kết luận này được hỗ trợ bởi các nghiên cứu tương tác protein trên hệ protein SARS-CoV (35).Phân tích MS đã xác định amin chính của dư lượng đầu N của nsp9 là vị trí NMPylation (phụ lục SI, Hình S5).Sự hình thành liên kết photphoramidate và nhóm amino đầu N giúp phân biệt hoạt động NMPylation qua trung gian NiRAN với phản ứng AMPylation qua trung gian Pseudomonas syringae SelO, xúc tác cho sự hình thành AMP liên kết O tại các gốc Ser, Thr hoặc Tyr. 22), và S. typhimurium YdiU tạo thành các chất cộng peptit-UMP liên kết O (với Tyr) và liên kết N (với His).Thông tin hạn chế có sẵn về họ protein SelO chỉ ra rằng các thành viên của họ protein lớn này khác nhau rất nhiều trong việc hình thành các chất cộng peptide-NMP.Đây là một quan sát thú vị đáng được nghiên cứu thêm.
Dữ liệu thu được trong nghiên cứu này khiến chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng NMPylation của nsp9 yêu cầu đầu N miễn phí.Trong bối cảnh sao chép của virus, điều này sẽ được cung cấp bởi sự phân cắt protein của vị trí xử lý nsp8|nsp9 trong polyprotein pp1a sao chép qua trung gian Mpro và pp1ab.Trong hầu hết các loại vi-rút Corona, sự khác biệt giữa vị trí cụ thể này (VKLQ|NNEI trong HCoV-229E) và tất cả các vị trí phân cắt Mpro của vi-rút Corona khác là Asn (chứ không phải một phần dư lượng nhỏ khác, chẳng hạn như Ala, Ser Hoặc Gly) chiếm P1â???Vị trí (36).Dữ liệu phân tách peptide thu được trong các nghiên cứu ban đầu cho thấy hiệu quả phân cắt của vị trí nsp8|nsp9 thấp hơn so với các vị trí khác, cho thấy rằng 1) vị trí cụ thể này có thể có vai trò điều tiết trong quá trình xử lý phối hợp kịp thời của đầu C vùng pp1a, hoặc 2) a Vai trò của đầu Nsp9 được bảo tồn đặc biệt trong quá trình nhân lên của virus (37).Dữ liệu của chúng tôi (Hình 5A) cho thấy dạng tái tổ hợp của nsp9 mang trình tự đầu cuối N thực đã được NMP hóa một cách hiệu quả bởi nsp12.Trình tự sườn ở đầu N đã bị loại bỏ bởi yếu tố Xa (nsp9-His6; phụ lục SI, Bảng S1) hoặc phân tách qua trung gian Mpro (nsp7-11-His6; Hình 5A và phụ lục SI, Bảng S1).Điều quan trọng là, tiền chất chứa nsp9 chưa cắt nsp7-11-His6 cho thấy khả năng kháng NMPylation của nsp12, phù hợp với dữ liệu của chúng tôi, chỉ ra rằng chất cộng nsp9-NMP được hình thành thông qua amin chính N-terminal (phụ lục SI, Hình S5) .Để hiểu sâu hơn về tính đặc hiệu của chất nền NiRAN, sau đó chúng tôi tập trung vào phần dư đầu cuối N liền kề của nsp9.Trong trường hợp không có các protein khác, chúng có cấu trúc linh hoạt, ngăn không cho chúng bị phát hiện ở dạng không nhãn của nsp9 (26 28, 38), cho thấy khả năng biến đổi tự nhiên hạn chế của chúng. Điều này là do trình tự quan trọng cụ thể (không liên quan đến cấu trúc thứ cấp) chức năng của đoạn N-terminal nsp9.Sự thay thế Ala của các dư lượng được bảo tồn trong khu vực này (Hình 5C và D và phụ lục SI, Hình S8) cho thấy rằng N3826 rất cần thiết cho nsp9 NMPylation trong ống nghiệm, trong khi sự thay thế N3825A và E3827A dẫn đến giảm NMPylation, trong khi sự thay thế M3829A và P3830A thì không .Rõ ràng ảnh hưởng đến nsp9 NMPylation.Mặc dù sự thay thế của N-terminal Asn (N3825A, N3825S) chỉ có tác dụng vừa phải đối với nsp9 NMPylation và sự nhân lên của virus trong nuôi cấy tế bào (Hình 5C và D), việc xóa chuỗi dư lượng Asn khỏi dipeptide N-terminal 3825-NN đã được chứng minh là Nó có khả năng gây chết vi-rút, cho thấy rằng cần phải có một dư lượng Asn trước một dư lượng khác ở đầu N, tốt nhất là Asn, mặc dù có vẻ như việc thay thế các dư lượng tương tự có thể được chấp nhận một phần (Hình 5B, C và D).Chúng tôi kết luận rằng dipeptide 3825-NN, đặc biệt là dư lượng N3826 thiết yếu và được bảo tồn trong phạm vi coronavirus (phụ lục SI, Hình S6), đảm bảo sự liên kết và định hướng chính xác của đầu Nsp9 trong vị trí hoạt động của NiRAN.
Việc thay thế Ala (E3827A) cho Glam được bảo tồn của tất cả các phân họ vẫn giữ lại nsp9 NMPylation trong ống nghiệm nhưng gây chết vi rút trong nuôi cấy tế bào (Hình 5C và D), cho thấy chức năng bổ sung của dư lượng này, ví dụ, trong các tương tác chính (NMPylat hoặc không biến đổi). ) nsp9 N-terminator và các yếu tố khác liên quan đến sự nhân lên của virus.Các đột biến Nsp9 không ảnh hưởng đến quá trình phân giải protein của nsp9 hoặc bất kỳ nsps lân cận nào (39) (Phụ lục SI, Hình S9), chỉ ra rằng các kiểu hình gây chết người của một số đột biến nsp9 được quan sát thấy không phải do sự rối loạn điều hòa của vùng pp1a của quá trình phân giải protein C. .
Dữ liệu trên cung cấp bằng chứng rằng sau khi xử lý qua trung gian Mpro đối với vị trí phân cắt nsp8|9 trong pp1a/pp1ab, đầu N của nsp9 có thể được UMPylat hóa (hoặc được sửa đổi một phần bằng NMP khác).Ngoài ra, việc bảo tồn tuyệt vời đầu N của nsp9 (bao gồm cả dư lượng Asn số ít và bất biến trong họ coronavirus) và dữ liệu di truyền ngược thu được trong nghiên cứu này (Hình 3E và 5D) đã khiến chúng tôi kết luận rằng nsp9 NMPylation được mô tả có liên quan về mặt sinh học và cần thiết cho sự nhân lên của virus Corona.Các hệ quả chức năng của sự biến đổi này vẫn cần được nghiên cứu, ví dụ, liên quan đến hoạt tính liên kết RNA nsp9 (dạng chưa biến đổi) được mô tả trước đó (2628).NMPylation N-terminal cũng có thể ảnh hưởng đến sự tương tác của nsp9 với cơ chất protein hoặc RNA hoặc sự hình thành các tổ hợp bốn cấp độ khác nhau.Những điều này đã được quan sát thấy trong các nghiên cứu về cấu trúc và đã được xác nhận là có liên quan về mặt chức năng đến sự sao chép của coronavirus, mặc dù đặc biệt là khi không có Trong trường hợp sửa đổi này (26-ââ29, 40).
Mặc dù độ đặc hiệu mục tiêu của miền NiRAN coronavirus vẫn cần được mô tả chi tiết hơn, nhưng dữ liệu của chúng tôi cho thấy độ đặc hiệu mục tiêu protein của miền NiRAN coronavirus là rất hẹp.Mặc dù việc bảo tồn các dư lượng vị trí hoạt động quan trọng (8, 16) trong miền NiRAN của tất cả các họ nidovirus hỗ trợ mạnh mẽ cho hoạt động của NMPylator được bảo tồn các protein này, nhưng việc nhận dạng các dư lượng túi liên kết cơ chất của miền này Bảo tồn và bảo tồn vẫn được đặc trưng và có thể khác nhau giữa các họ khác nhau của mục đích Nidovirales.Tương tự, các mục tiêu liên quan của các loại virus lồng nhau khác vẫn chưa được xác định.Chúng có thể là các chỉnh hình từ xa của nsp9 hoặc các protein khác, bởi vì các trình tự bên ngoài năm miền sao chép thường được bảo tồn trong các virus lồng nhau ít được bảo tồn hơn (8), bao gồm cả mảng bộ gen giữa Mpro và NiRAN, Trong số đó, nsp9 nằm ở vi-rút corona.
Ngoài ra, hiện tại chúng tôi không thể loại trừ khả năng miền NiRAN có các mục tiêu bổ sung (bao gồm cả mạng di động).Trong trường hợp này, điều đáng nói là các chất tương đồng của vi khuẩn trong loại protein NMPylators (NMPylators) mới nổi này (30, 31) dường như có “bộ điều chỉnh chính”?NMP điều chỉnh nhiều loại protein tế bào để điều chỉnh hoặc loại bỏ các hoạt động xuôi dòng của chúng, từ đó đóng vai trò trong nhiều quá trình sinh học, chẳng hạn như phản ứng căng thẳng tế bào và cân bằng nội môi oxy hóa khử (22, 33).
Trong nghiên cứu này (Hình 2 và 4 và Phụ lục SI, Hình S3 và S5), chúng tôi có thể chứng minh rằng nsp12 đã chuyển phần UMP (NMP) sang một vị trí (được bảo tồn) trong nsp9, trong khi các protein khác không bị biến đổi trong được sử dụng Trong các điều kiện, tính đặc hiệu của chất nền được xác định rõ ràng (chứ không phải lỏng lẻo) được hỗ trợ.Phù hợp với điều này, so với N-terminal nsp9 NMPylation, hoạt động NMPylation của chính nsp12 rất thấp, việc phát hiện nó đòi hỏi thời gian phơi sáng tự động lâu hơn và sử dụng nồng độ nsp12 tăng gấp 10 lần.Ngoài ra, phân tích MS của chúng tôi không cung cấp được bằng chứng cho NMPylation của nsp12, điều này cho thấy rằng việc tự NMPylation của miền NiRAN (tốt nhất) là một hoạt động thứ yếu.Tuy nhiên, cần lưu ý rằng các nghiên cứu khác đã cung cấp bằng chứng sơ bộ rằng trạng thái tự AMPylation của NMPylator vi khuẩn có thể kiểm soát hoạt động NMPylation của chúng trên các cơ chất protein khác (22, 33).Do đó, cần có nhiều nghiên cứu hơn để điều tra các tác động chức năng có thể có của các hoạt động tự NMPylation được báo cáo đối với EAV nsp9 (16) và coronavirus nsp12 (nghiên cứu này), bao gồm cả hiệu ứng giống như người đi kèm được đề xuất đối với việc gấp miền C-terminal RdRp ( 16) ).
Trước đây, một số giả thuyết liên quan đến các chức năng xuôi dòng có thể có của miền NiRAN nidovirus đã được xem xét, bao gồm RNA ligase, guanylate transferase gắn RNA và hoạt động mồi protein (16), nhưng không có giả thuyết nào tương thích với các chức năng xuôi dòng có sẵn.Thông tin thu được ở các vị trí sau là hoàn toàn giống nhau về thời gian mà không cần đưa ra giả định bổ sung.Dữ liệu thu được trong nghiên cứu này phù hợp nhất với (nhưng không thể chứng minh) rằng miền NiRAN có liên quan đến việc bắt đầu tổng hợp RNA do protein tạo ra.Trước đây người ta tin rằng chức năng của miền NiRAN trong 5??²-Phản ứng gắn nắp RNA hoặc gắn RNA không bị ảnh hưởng bởi những điều này và Hỗ trợ của dữ liệu khác.Do đó, ví dụ: vị trí hoạt động của NiRAN được coi là có Asp được bảo tồn làm cơ sở chung (D252 trong Pseudomonas syringae SelO; D4271 trong HCoV-229E pp1ab; D208 trong SARS-CoV-2 nsp12) (SI Phụ lục, hình 2 ).S2) (17, 22, 33), trong khi quá trình xúc tác trong enzyme RNA ligase và RNA phụ thuộc ATP được thực hiện bởi enzyme cộng hóa trị-(lysyl-N)-NMP trung gian, bao gồm dư lượng Lys không thay đổi ( 41).Ngoài ra, độ đặc hiệu dựa trên trình tự đáng chú ý của coronavirus NiRAN đối với các mục tiêu protein được bảo tồn và độ đặc hiệu thoải mái đối với các đồng cơ chất NTP (thích UTP) chống lại enzyme giới hạn qua trung gian NiRAN hoặc các chức năng giống RNA ligase.
Rõ ràng, cần phải thực hiện thêm rất nhiều công việc để xác minh và nếu được chứng minh, hãy giải thích chi tiết về vai trò có thể có của nsp9-UMP (nsp9-NMP) trong quá trình tổng hợp RNA do protein tạo ra, điều này sẽ kết nối một số báo cáo thú vị nhưng (cho đến nay) đã được báo cáo trước đây. .Quan sát biệt lập.Ví dụ, người ta đã xác định rằng phần cuối của chuỗi RNA âm của coronavirus bắt đầu bằng chuỗi oligo(U) (42, 43).Quan sát này phù hợp với ý tưởng rằng quá trình tổng hợp RNA chuỗi âm được bắt đầu bằng cách liên kết dạng UMPylat của nsp9 với đuôi poly(A) (kích hoạt), có thể được thúc đẩy bằng cách liên kết RNA của nó. Hoạt động và/hoặc tương tác với một protein RTC khác.Sau đó, phần UMP do nsp9 cung cấp có thể được sử dụng làm “mồi” cho quá trình oligouridyl hóa qua trung gian nsp7/8/nsp12, sử dụng đuôi 3??²-poly(A) trong RNA bộ gen hoặc trình tự chứa oligo (A) khác đóng vai trò như một khuôn mẫu, tương tự như cơ chế được thiết lập cho protein VPg của picornavirus (44).Điều gì sẽ xảy ra nếu đề xuất đó là “không chuẩn mực”????Việc bắt đầu quá trình tổng hợp RNA chuỗi âm (do protein gây ra) cung cấp một liên kết đến các quan sát, chỉ ra rằng RNA chuỗi âm tính của coronavirus có UMP (thay vì UTP) ở cuối (42), được coi là chỉ ra rằng axit nucleic Dicer cắt đầu cuối được phosphoryl hóa bởi một endnuclease đặc hiệu uridine chưa xác định.Nếu được xác nhận, hoạt động thủy phân axit nucleic này có thể giúp giải phóng dạng oligomeric UMPylat của nsp9 từ đầu 5 ² của chuỗi âm mới sinh.Vai trò có thể có của nsp9 trong việc tạo mồi protein cũng phù hợp với các nghiên cứu di truyền ngược trước đây, cho thấy nsp9 (và nsp8) tương tác chặt chẽ và đặc biệt với thành phần RNA hoạt động cis được bảo tồn ở gần đầu thứ 3 của bộ gen virus corona.45).Theo báo cáo này, những quan sát trước đây hiện có thể được kiểm tra lại và mở rộng thông qua nghiên cứu sâu hơn.
Tóm lại, dữ liệu của chúng tôi đã xác định hoạt động cụ thể của thẻ enzyme virus lồng nhau độc quyền được liên kết với RdRp tại đầu N.Trong vi rút Corona, hoạt động UMPylator/NMPylator qua trung gian NiRAN mới được phát hiện này được sử dụng để dựa vào Mn2+ và các gốc Asn liền kề và gây ra sự hình thành liên kết photphoramidate (năng lượng thấp) với amin bậc một đầu N.Thông qua sự phân tách qua trung gian Mpro tại vị trí phân cắt nsp8|9, mục tiêu nsp9 có thể được sử dụng cho NMPylation, biểu thị sự ghép nối chức năng giữa protease và miền NiRAN, mở rộng đến RdRp.Việc bảo tồn các dư lượng quan trọng trong vị trí hoạt động nsp12 NiRAN và mục tiêu nsp9, kết hợp với dữ liệu thu được từ hai loại vi-rút Corona bao gồm SARS-CoV-2, cung cấp bằng chứng mạnh mẽ cho thấy nsp9 NMPylation là một loại vi-rút Corona. Các đặc điểm bảo thủ cũng là một bước quan trọng trong quá trình nhân lên của vi-rút.Dữ liệu hiện có khiến chúng tôi kết luận rằng vai trò cụ thể của dạng nsp9 NMPylat trong quá trình tổng hợp RNA do protein tạo ra là một kịch bản hợp lý đối với coronavirus và các loại virus lồng nhau khác, và NiRAN cũng có thể nhắm mục tiêu vào các protein không xác định khác.Điều chỉnh virus.Tương tác máy chủ.Nếu được xác nhận, sự tham gia của các mồi protein trong quá trình tổng hợp RNA của virus sẽ làm tăng ái lực trình tự của các miền Mpro/3CLpro và RdRp giữa siêu nhóm coronavirus được phát hiện trước đó và siêu nhóm giống picornavirus (9), hiện đã được thống nhất trong Pisonivirites được thành lập gần đây (9). 46) trong danh mục.
Dữ liệu của chúng tôi cũng cho thấy các hoạt động cơ bản, chọn lọc và bảo thủ của enzyme được xác định trong nghiên cứu này có thể được sử dụng làm mục tiêu cho thuốc kháng vi-rút.Các hợp chất cản trở sự liên kết (và sửa đổi tiếp theo) của đầu Nsp9 được bảo tồn trong vị trí hoạt động của NiRAN có thể được phát triển thành các loại thuốc chống vi-rút hiệu quả và linh hoạt, thích hợp để điều trị các loại vi-rút Corona ở động vật và người thuộc các chi (phụ) khác nhau. , bao gồm SARS-CoV-2 và Hội chứng hô hấp Trung Đông do virus Corona.
Trình tự mã hóa của protein coronavirus tạo ra trong nghiên cứu này được khuếch đại bằng RT-PCR sử dụng RNA phân lập từ Huh-7 bị nhiễm HCoV-229E hoặc Vero E6 bị nhiễm SARS-CoV-2 và được chèn vào bằng quy trình nhân bản tiêu chuẩn.pMAL-c2 (Phòng thí nghiệm sinh học New England) hoặc vectơ biểu hiện pASK3-Ub-CHis6 (47) (Phụ lục SI, Bảng S1 và S2).Sự thay thế codon đơn được đưa vào bằng phương pháp gây đột biến định hướng tại chỗ dựa trên PCR (48).Để tạo ra protein tổng hợp MBP, các tế bào E. coli TB1 đã được biến nạp với cấu trúc plasmid pMAL-c2 thích hợp (phụ lục SI, Bảng S1).Protein tổng hợp được tinh chế bằng sắc ký ái lực amyloza và được phân cắt bằng yếu tố Xa.Sau đó, protein gắn thẻ His6 ở đầu C được tinh chế bằng sắc ký ái lực kim loại cố định Ni (Ni-IMAC) như mô tả trước đây (49).Để tạo ra protein tổng hợp ubiquitin, các tế bào E. coli TB1 đã sử dụng cấu trúc plasmid pASK3-Ub-CHis6 thích hợp (Phụ lục SI, Bảng S1 và S2) và DNA plasmid pCGI mã hóa C-terminal hydrolase 1 đặc hiệu ubiquitin (Ubp1).Chuyển hóa (47).Protein coronavirus gắn thẻ His6 ở đầu C đã được tinh chế như mô tả trước đây (50).
Thử nghiệm tự NMPylation của HCoV-229E nsp12-His6 được thực hiện như mô tả trong EAV nsp9 (16).Tóm lại, nsp12-His6 (0,5 µM) chứa 50 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)-KOH, pH 8,0, 5 mM dithiothreitol ( DTT), 6 mM MnCl2, 25 µM đệm, ủ NTP được chỉ định và 0,17 µM khớp với [α32-P]NTP (3.000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) ở 30°C trong 30 phút.Trong tất cả các thử nghiệm NMPylation (tiêu chuẩn) khác của nsp9 NMPylation qua trung gian nsp12, các điều kiện phản ứng được điều chỉnh như sau: nsp12-His6 (0,05 µM) và nsp9-His6 (4 µM) với sự có mặt của 50 mM HEPES-KOH (pH 8,0 ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 µM được chỉ định NTP và 0,17 µM khớp với [α32-P]NTP.Sau khi ủ trong 10 phút ở 30°C, mẫu phản ứng được trộn với dung dịch đệm mẫu SDS-PAGE: 62,5 mM tris(hydroxymethyl)aminomethane HCl (pH 6,8), 100 mM DTT, 2,5% SDS, 10% glycerol và 0,005% bromophenol màu xanh da trời.Protein bị biến tính bằng cách đun nóng ở 90°C trong 5 phút và được phân tách bằng 12% SDS-PAGE.Gel được cố định và nhuộm màu bằng dung dịch Coomassie Brilliant Blue (40% metanol, 10% axit axetic, 0,05% Coomassie Brilliant Blue R-250), khử màu và phơi trên màn hình chụp ảnh lân quang trong 20 giờ (để phát hiện nsp12 từ NMPylation) hoặc (tối đa) 2 giờ (để đánh giá NMPylation nsp9).Máy chụp ảnh Typhoon 9200 (GE Healthcare) đã được sử dụng để quét màn hình và ImageJ được sử dụng để phân tích cường độ tín hiệu.
Để phân tích MS, 1 µM nsp12-His6 và 10 µM nsp9 (không có thẻ hexahistidine) đã được sử dụng trong phân tích NMPylation (phụ lục SI, Bảng S1) và nồng độ tăng thêm 500 µM UTP và GTP đã được sử dụng.Tùy thuộc vào nồng độ và chất lượng protein dự kiến, hệ thống HPLC Waters ACQUITY H-Class được trang bị cột MassPrep (Waters) đã được sử dụng để khử muối trực tuyến từ 1 đến 10 µL dung dịch đệm protein.Protein đã khử muối được rửa giải vào nguồn ion phun điện của máy quang phổ khối Synapt G2Si (Waters) thông qua gradient của dung dịch đệm A (nước/axit formic 0,05%) và dung dịch đệm B (acetonitril/axit formic 0,045%) và nhiệt độ cột là 60°C và tốc độ dòng 0,1 mL/phút: rửa giải đẳng cấp với 5% A trong 2 phút, sau đó gradient tuyến tính đến 95% B trong vòng 8 phút và duy trì 95% B trong 4 phút nữa.
Các ion dương có dải khối từ 500 đến 5000 m/z được phát hiện.Glu-fibrinopeptide B được đo 45 giây một lần để tự động điều chỉnh độ trôi khối.Sử dụng phần mềm công cụ MassLynx với tiện ích mở rộng MaxEnt1 để giải mã phổ trung bình sau khi trừ đường cơ sở và làm mịn.
UMPylat HCoV-229E nsp9 được tiêu hóa bằng cách thêm trypsin biến đổi cấp độ trình tự (Serva) và ủ qua đêm ở 37°C.Cột quay Chromabond C18WP (số bộ phận 730522; Macherey-Nagel) đã được sử dụng để khử muối và cô đặc các peptide.Cuối cùng, peptit được hòa tan trong 25 µL nước, chứa 5% axetonitril và 0,1% axit formic.
Các mẫu được MS phân tích bằng máy quang phổ khối Orbitrap Velos Pro (Thermo Scientific).Hệ thống nanoâ HPLC tối ưu (Dionex), được trang bị đầu cuối gắn tùy chỉnh 50 cm??Cột 75 μm C18 RP được đóng gói bằng các hạt từ tính 2,4 μm (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) Kết nối với máy quang phổ khối trực tuyến thông qua nguồn phun nano Proxeon;tiêm 6 µL dung dịch tiêu hóa trypsin vào đường kính trong 300 µm ×??Cột cô đặc trước C18 PepMap 1 cm (Thermo Scientific).Sử dụng nước/axit formic 0,05% làm dung môi, mẫu được tự động giữ lại và khử muối ở tốc độ dòng 6 µL/phút.
Các gradient sau đây của nước/axit formic 0,05% (dung môi A) và acetonitril 80%/axit formic 0,045% (dung môi B) được sử dụng để tách các peptide tryptic ở tốc độ dòng 300 nL/phút: 4% B cho 5 phút, sau đó là 30 A gradient tuyến tính đến 45% B trong vòng vài phút và tăng tuyến tính lên 95% dung môi B trong vòng 5 phút.Nối cột sắc ký với bộ phát nano bằng thép không gỉ (Proxeon) và phun trực tiếp dung dịch rửa giải vào mao quản được gia nhiệt của khối phổ sử dụng điện thế 2.300 V. Quét khảo sát với độ phân giải 60.000 trong máy phân tích khối Orbitrap được liên kết với ít nhất ba lần quét dữ liệu MS/MS, loại trừ động trong 30 giây, sử dụng phân ly do va chạm bẫy ion tuyến tính hoặc phân ly va chạm năng lượng cao hơn kết hợp với phát hiện quỹ đạo, Độ phân giải là 7.500.
Thời gian đăng: 03-08-2021